●  PCR试剂和设备

●  1ug任何舍有scFv及（GIy₄Ser）₃接头的载体

●  RHuJ_H引物、RHuVκ引物和RHuVλ引物，10pmol/ul

 

[方法]

1．在0．5ml微量离心管内配制用于扩增的主混合液。所显示的主混合液用于V_H—Vκ接头。对于V_H—Vλ接头的主混合液，n＝29。

                        单个反应主混合液/ul         （n＝25）

●  水                     37                         925

●  10×Vent缓冲液        5．0                        125

●  20×dNTPs             2．5                        62．5

●  Vent DNA聚合酶        0．5                        12．5

2．取24支0．5ml试管，每管分别加入RHuJ_H引物和RHuVκ引物，各2ul。RHuJ_H引物和RHuVκ引物共有24种可能的结合形式。而对于V_H—Vλ接头，则用RHuVl引物替代RHuVκ引物即可，共可编为28管。如无加热盖，可以加入l滴轻质矿物油覆盖反应液。

3．设1个阴性对照管，加入50ul主混合液。

4．每个样本取1．0ul scFv基因模板（约1ng），加入到主混合液中。

5．取46u1主混合液分别加入到步骤2已制备的24个管内。

6．预加热PCR反应格到94℃。

7．以94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃1分钟的条件共循环25次，扩增接头序列。

8．将PCR产物用2．0％TBE琼脂糖胶电泳纯化，切取PCR产物；用Geneclean抽提，并重悬DNA于50ul水中。