选择3～5轮后，随机挑取克隆加入96孔微量滴定板中 并诱导表达可溶性scFv。然后，在包被有相关抗原的96孔微量滴定板中，用ELISA分析含有可溶性scFv的细菌上清。此过程可以识别出那些结合了抗原的scFv。但即便采用上述严谨性选择后，ELISA阳性克隆中仅有部分克隆的亲和力比野生型高。ELISA信号强度不能很好地显示哪个克隆具有较低的Ka值，而且更为普 遍的是它与scFv表达水平相关。因此，这就需要一种筛选ELISA阳性克隆的技术，能识别出具有较低Ka值的克隆。竞争性或抑制性ELISA就是这样的技术。或者可以利用以下事实：koff降低一般是导致高亲和力提高的主要动力学机制，因此通过测定解离速率就可以识别出那些亲和力得到提高的抗体。因为κoff是非浓度依赖的（不同于kon，），所以无需纯化抗体片段就能测定κoff，比如采用类似BIAcore的仪器进行SRP分析。我们已发现这是鉴别高亲和力scPv的一项很有用的技术，还可以以此来评分亲和力成熟了的克隆的等的。
首先，我们用ELISA识别出结合性克隆。然后，随机挑取20一50个选择的ELISA阳性克隆；根据κoff大小排队比较。再选出那些κoffzui低的克隆进行亚克隆、纯化，并用BIAcore进行SRP测定其Kd值。需要注意的是，在scFv情况下，解离曲线形状可以指示出是否存在单个或多个κoff值。有多个κoff值的scFv（当以R1／R0对于作图时，出现一条曲线对一条直线）是单体和二聚体的混合物，避免用于续后的研究。
www.sqegr.cn